共识概述

• 制定背景
  • 基层医院临床医生对自身免疫性疾病（AID）认知不足，检验科自身抗体检测项目开展少
  • 河南AID患者群体庞大，三级公立医院自身抗体检测开展率68.59%，二级公立医院仅40.00%
  • 已开展检测的机构中46.55%检测项目不足20项，室内质控未全覆盖，国家临检中心室间质评参评率仅67.24%
• 制定目的
  • 为河南各级医院尤其是基层医院自身抗体实验室检测提供推荐意见
  • 实现自身抗体检测标准化、同质化，为检验结果互认奠定基础，降低患者及医保支出
• 核心内容
  • 覆盖自身抗体检测方法学、性能验证与质量控制、临床意义及结果解读三部分，重点介绍不同检测方法特点及差异

自身抗体检测的临床价值

• 自身抗体是AID重要生物学标志物，临床症状出现前数月至数年即可检出，不同疾病对应抗体种类不同
• 检测可用于AID早期筛查、疾病诊断、病情判断、治疗评价及预后评估

自身抗体检测方法学

间接免疫荧光法（IIF）

• 应用定位
  • 抗核抗体筛选检测最有效方法之一，是抗核抗体检测的参考方法
  • 广泛用于非组织器官特异性自身抗体（抗核抗体、抗中性粒细胞胞浆抗体等）及皮肤、消化系统等组织器官特异性自身抗体检测
• 结果特点
  • 通过荧光显微镜观察荧光强度及分布，结果包含荧光模式、滴度等信息
• 优点：抗原谱完整，抗原为天然构象、特异性高、可探索未知抗原；制片可自动化或手工操作，手工法设备投入低、操作简单、易于推广
• 局限性：实验室间检测结果差异大、标准化程度低，荧光判读需经专业技术培训；数字化判读待成熟；手工操作占比高、自动化程度低
• 优化方案
  • 自动化判读可提高检测效率、降低人工误差，复杂荧光核型需双人独立阅片，结果不一致时讨论、查阅病历或与临床沟通后报告
• 常见问题与改进
  • 操作及环境问题：可致假阳性/假阴性、结果重复性差等，需定期校准加样器，控制实验温度，严格按规程操作，提升操作技能
  • 判读差异问题：可致荧光判读有误、不一致，需加强人员培训，考核合格上岗，定期核对判读结果
  • 试剂差异问题：不同品牌试剂结果不一致，需选择经验证的高质量试剂
  • 设备问题：显微镜光源不稳定可影响结果，需更换老化灯泡或维护设备，推荐使用LED光源

靶抗原确认试验

酶联免疫吸附法（ELISA）

• 应用特点
  • 基于抗原抗体特异性反应，可定量检测多种自身抗体，操作简单易掌握
  • 为靶抗原推荐检测方法之一，目前临床应用占比呈下降趋势
• 优点：易操作、成本低、应用范围广、敏感性及特异性尚可
• 局限性：操作烦琐、重复性差、线性范围窄、速度慢、通量较低、不支持随到随检
• 检测要求
  • 根据需求选择检测项目和试剂盒，严格按说明书和标准操作规程操作
  • 疑似阳性样本需用其他方法验证
• 常见问题与改进
  • 手工操作误差：可致假阴性/假阳性，需严格执行操作规程，减少人为干扰
  • 加样不规范：可致假阴性/假阳性，需将液体加至板孔底部，避免刮蹭孔壁、溅出或产生气泡，每次加样更换枪头防交叉污染
  • 温育不标准：可致假阴性，推荐使用恒温水浴箱，严格控制温育时间和温度，定期校准水浴箱
  • 洗涤不彻底：可致假阴性，推荐使用全自动洗板机，定期清洁维护设备
  • 显色比色误差：可致假阳性/假阴性，需严格控制显色温度和时间，选择适宜波长测量
  • 酶标板差异：可致假阳性/假阴性，需对酶标板进行性能验证，首选聚苯乙烯材质酶标板，不同批次标准品不可混用，定期校准移液器、维护酶标仪

化学发光法（CLIA）

• 应用定位
  • 特异性抗原抗体反应与化学发光法结合的定量检测方法，自动化程度高、速度快，有助于实现检测标准化，在疾病疗效监测中作用重要
• 优点：敏感性及特异性强、精确度高、检测范围广、自动化程度高、随机进样、项目灵活组合、可定性或定量检测
• 局限性：通量相对不高、成本高
• 方法分类及特点
  • 直接化学发光免疫分析法（DCLIA）：以吖啶酯为发光物质，背景值低、干扰少、发光效率高，灵敏度稍低、发光持续时间短，检测成本高
  • 化学发光酶免疫分析法（CLEIA）：以辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶为标记物，灵敏度高、标记物结合稳定，反应速度慢、酶活性易受外界影响，检测成本低
  • 电化学发光免疫分析法（ECLIA）：以三联吡啶钌为发光物质，灵敏度高、重现性好、标志物稳定，仪器维护费用高、易受环境因素影响，检测成本高
• 常见问题与改进
  • 标本问题：可致假阴性/假阳性，需保证标本量充足，采用分离胶真空管采血，标本静置30min后3000r/min离心10min
  • 仪器问题：可致假阴性/假阳性，需按规程做好仪器日、周、月保养，定期清洗加样针、清洗针
  • 试剂问题：可致假阴性/假阳性，需充分混匀试剂避免产生气泡，及时更换过期试剂

免疫印迹法（IBT）

• 应用特点
  • 用于蛋白质定性或半定量检测，操作简单、成本低、无需特殊设备，基层单位自身抗体谱检测可优先选择
  • 存在检测项目固定、需批量检测、难以随机上样的劣势，目前已从手工操作向半自动/全自动检测转变
• 优点：抗干扰能力较强，可自动化或手工操作，支持多项联检
• 局限性：项目不可拆分，定性检测，不支持随机进样
• 结果判读要求
  • 采用目测法或软件扫描条带灰度值分析法，目测法处于可疑区间的结果需复审或复检
• 常见问题与改进
  • 标本问题：溶血、脂血可致膜条黑染，需加长离心时间，样本适当稀释，必要时备注或重新采样，可通过增加抗体稀释比例、使用封闭剂等减少非特异性结合
  • 操作问题：手工加样错误、洗涤不彻底可致假阴性/假阳性，需检查洗涤液配比，保证洗涤次数、体积及时间，样本污染时重新检测
  • 多条带阳性：需区分交叉反应或表位扩散，交叉反应需多方法学平台确认
  • 质控带不显色：提示实验失败，需重复实验或更换试剂批次

流式荧光法

• 应用特点
  • 高通量流式免疫学检测方法，一次分析可检测多项指标，具有高通量、随时待检优势
• 优点：高通量，高敏感性，高特异性，易自动化，支持随机进样，可定性或定量检测，支持多项联检
• 局限性：项目不可拆分
• 优化方案
  • 推荐与IIF联合检测、多种抗体和标志物联合检测，提高AID诊断敏感度和特异度
• 常见问题与改进
  • 试剂问题：不同品牌、批次试剂或保存不当可致假阴性/假阳性，需使用同一品牌配套试剂，不同批次不可混用，试剂2~8℃避光保存
  • 稳定性问题：微球编码荧光相近或放置时间过长可影响结果，需选择有颜色差异的微球编码并做性能验证，微球4℃储存可保存100d
  • 特异度问题：患者体内非特异性抗体增多可致假阳性，可通过试剂空白荧光微球确认非特异性结合情况

数码液相芯片法

• 应用特点
  • 全自动多重液相芯片免疫检测法，可定量或定性检测多种生物分子，是自身抗体多重指标联检的新兴技术
• 优点：高通量，高特异性，高灵敏度，全自动化，支持随机进样，环境适应性强，可定性或定量检测，支持多项联检
• 局限性：项目不可拆分，应用时间较短，有待大量临床数据验证

方法学选择原则

• 检测过程中抗凝剂、溶血、嗜异性抗体等干扰物质可致所有方法出现假阳性/假阴性结果
• 推荐实验室采用IIF法联合靶抗原确认试验进行组合检测，根据实际需求选择适宜的靶抗原确认试验
• 定量检测方法逐渐应用，可为疾病诊断和治疗监测提供更有力支持

性能验证

• 总体要求：开展临床检测前选用参考品或真实临床样本，通过简化的重复性及方法学比较实验，对检测系统整体的精密度和准确度等分析性能进行验证
• 定性项目性能验证
  • 验证内容至少包括符合率、检出限、临界值、重复性、抗干扰能力
  • 半定量检测方法除评估定性符合率外，还需分析核型和抗体滴度结果
• 定量项目性能验证
  • 验证内容至少包括正确度、精密度和可报告范围

质量控制

• 室内质量控制
  • 质控品来源：优先选择第三方商品化质控品，无合适第三方质控品时可选用厂家配套质控品或实验室自制质控品；自制质控品需为人血清基质、添加剂少、均匀性及稳定性好，使用前需验证稳定性及均一性
  • 操作原则：无论定性或定量项目，至少设置阴性、弱阳性两个水平质控；定量项目需确定靶值和标准差，统计弱阳性质控品定量检测数值，绘制Levey-Jennings质控图；每月汇总质控结果；质控品批号更换时需重新建立靶值和标准差
  • 失控处理：立即停止实验、查找原因，采取纠正措施，评估对检测结果的影响，必要时追回已发报告，制定预防措施
• 室间质量评价：参加国家卫健委临检中心、省市级临检中心及NCRC组织的室间质评，收到成绩后总结分析，不合格项目及时分析原因并纠正
• 实验室内部比对：内容包括人员比对、相同项目不同检测系统比对、同一检测系统不同模块比对；人员比对每年不少于2次，仪器间比对每年不少于1次；比对不合格及时分析原因并纠正

临床意义及结果解读

• 临床意义
  • 早期预警：自身抗体可在自身免疫病（AID）临床症状出现前数年被检测到
  • 诊断和鉴别诊断：不同AID有特定自身抗体谱，部分检测策略已纳入疾病诊断或分类标准
  • 监测病情和治疗效果：自身抗体水平变化与部分AID活动度密切相关，可反映疾病进展和治疗效果，监测时需定期使用同种定量检测方法
• 结果解读注意事项
  • 自身抗体与AID无绝对对应关系，AID诊断需综合临床表现、实验室检查、影像学资料等多方面信息
  • AID具有高度异质性，同种疾病可有不同自身抗体，同种自身抗体也可见于不同疾病，检测方法、疾病特征、种族等均会影响自身抗体与AID的临床相关性
  • 多种自身抗体谱联合检测可显著提高诊断灵敏度和特异度，需根据情况开展相关联合检测并规范操作与质控

常见问题及处理

• 检测无效问题
  • 可能原因：样本非特异性反应、样本污染或pH/温度不稳定、芯片吸取量少或洗涤丢失过多
  • 处理措施：重新复测
• 结果异常（假阴性/假阳性、结果不一致）问题
  • 标本问题：原因包括标本质量不合格、错抽、保存不当；处理为参考相关标准制定标本采集手册，必要时备注或重新采样送检
  • 室内质控问题：原因包括偶然误差、试剂稳定性差、第三方质控品有限、仪器故障；处理为查找失控原因对应解决，减少试剂批号更换，选用合适质控品，定期维护检修仪器
  • 人员操作、仪器故障问题：原因包括操作不熟练、仪器故障；处理为加强人员操作培训，考核合格上岗，定期维护仪器，故障排除后留样比对
  • 钩状效应：原因为抗体浓度过高、解离；处理为加大稀释倍数重新检测
  • 内部干扰：原因为嗜异性抗体、类风湿因子等干扰；处理为采用试剂适配的吸附剂、阻断剂重新检测
  • 试剂差异问题：原因为缺少可溯源国际标准品、抗原片段/表位/生产工艺不一致、试剂稳定性差；处理为实验前进行不同厂家性能比对，结果不一致时参考多种方法学结果，监测抗体水平采用相同品牌试剂
  • 方法学差异问题：原因为灵敏度、检出限、抗原表位不同；处理为多种方法学联合检测并结合临床，同一项目只报告一种方法学结果并备注
  • 与临床诊断不一致：原因包括实验室内部问题、疾病亚临床阶段、用药影响；处理为排查实验室操作问题，结合临床情况综合判断